(1-1) پیشگفتار. 1
(1-2) کلیات… 4
(1-2-1) اثر همسایگی پرتوی.. 4
(1-2-2) مکانیسم اثر همسایگی پرتوی.. 5
(1-2-2-1) نقش GJIC در انتقال پیام های همسایگی.. 6
(1-2-2-2) متابولیسم های اکسیداسیون.. 6
(1-2-2-3) مسیر مولکولی MAPK، سایتوکین ها و عوامل رشد.. 7
(1-2-2-4) شار کلسیم.. 9
(1-2-2-5) تغییرات مولکولی ایجاد شده در سلول به دنبال تابش پرتوی یونیزان.. 10
(1-2-2-6) تغییرات بیان ژنی.. 11
(1-3) رادیوتراپی.. 13
(1-3-1) پرتودرمانی و اثر همسایگی.. 13
(1-4) حفاظت پرتوی و اثر همسایگی.. 15
(2-1) نوع سلول مورد بررسی.. 19
(2-1-1) مطالعاتی که در آنها کاهش اثر همسایگی با افزایش دز مشاهده شده است. 20
(2-1-2) نقش تغییر غلظت محیط کشت تابشی در ایجاد اثر همسایگی پرتوی.. 20
(3-1) کشت سلولی.. 25
(3-1-1) مواد مصرفی.. 25
(3-1-1-1) رده سلولی QU-DB.. 25
(3-1-1-2) رده سلولی MRC5.. 25
(3-1-1-3) محیط کشت سلولی.. 25
(3-1-1-4) نحوه تهیه محیط کشت… 25
(3-1-1-5) نحوه تهیه محیط کشتDMEM… 26
(3-1-1-6) (FBS) Fetal Bovine Serum… 26
(3-1-1-7) آنتی بیوتیک… 26
(3-1-1-8) ال-گلوتامین.. 26
(3-1-1-9) تریپسین - EDTA.. 26
(3-1-1-10) بافر. 27
(3-1-1-11) تریپان بلو. 27
(3-1-1-12) فریزینگ مدیوم. 27
(3-1-1-13) دی متیل سولفوکساید(DMSO). 27
(3-1-1-14) فلاسک کشت سلولی.. 27
(3-1-1-15) فیلتر سرنگی.. 27
(3-1-2) وسایل و تجهیزات… 28
(3-1-2-1) هود لامینار. 28
(3-1-2-2) انکوباتور. 28
(3-1-2-3) سانتریفیوژ. 28
(3-1-2-4) لام نئوبار. 28
(3-1-2-5) میکروسکوپ… 28
(3-1-2-6) سیستم های خنک کننده شامل یخچال، فریزر و تانک نیتروژن.. 29
(3-1-2-7) سیستم های استریلیزاسیون شامل اتوکلاو، فور و فیلتر هولدر. 29
(3-1-3) روش کار کشت سلولی.. 29
(3-1-3-1) تهیه سلول.. 29
(3-1-3-2) پاساژ و تکثیر سلول ها 29
(3-1-3-3) ذخیره سازی سلول ها 30
(3-1-3-4) خارج کردن سلول ها از انجماد. 30
(3-1-3-5) شمارش سلولی به روش تریپان بلو. 30
(3-1-3-6) تعیین زمان دو برابر شدن سلول ها 30
(3-2) روش کار. 31
(3-2-1) روش جمع آوری اطلاعات… 31
(3-2-2) معرفی آزمون سنجش میکرونکلئی.. 31
(3-2-2-1) آزمون میکرونوکلئی.. 31
(3-2-2-2) مواد مصرفی در آزمون میکرونوکلئی.. 32
(3-2-2-2-1)سیتوکلایزین B.. 32
(3-2-2-3) تهیه محلول سیتوکلازینB در DMSO… 32
(3-2-2-4) تعیین غلظت مناسب سیتوکلازینB.. 32
(3-2-2-5) زمان بهینه حضور سیتوکلازینB در محیط کشت سلول.. 32
(3-3) مراحل انجام آزمایش… 33
(3-3-1) تابش دهی.. 33
(3-3-1-1) نحوه تابش سلول ها 33
(3-3-1-2) تهیه نمونه های آزمایش… 33
(3-3-1-3) تابش دهی و ایجاد اثر همسایگی.. 33
(3-3-1-4) فیکساسیون سلول ها 33
(3-3-1-5) رنگ آمیزی سلول ها 34
(3-3-1-6) مشاهده لام ها به وسیله میکروسکوپ… 35
(3-3-1-7) معیارهای تشخیص سلول دو هسته ای.. 35
(3-3-1-8) معیارهای تشخیص میکرونوکلئی.. 35
(3-3-2) نقش تغییر غلظت محیط کشت انتقالی به سلول های همسایه در ایجاد اثر همسایگی پرتوی.. 35
(3-3-3) تست MTT.. 36
(3-3-3-1) اساس تست MTT.. 36
(3-3-3-2) نحوه تابش سلول ها 37
(3-3-3-3) تهیه نمونه های آزمایش… 37
(3-3-3-4) افزودن MTT.. 38
(3-3-3-5) تهیه نمونه های آزمایش (اثر غیر مستقیم). 38
(3-3-3-6) تابش دهی و ایجاد اثر همسایگی.. 38
(3-3-4) تست کلونی.. 39
(3-3-4-1) کلونی زایی به عنوان شاخص بقا 39
(3-3-4-2) روش Clonogenic Assay. 39
(3-3-4-3) اننخاب تعداد سلول مناسب برای Colony assay. 40
(3-3-4-4) تعیین تعداد مناسب سلول با توجه به افزایش دز برای انجام Colony assay. 40
(3-3-4-5) تابش دهی و بررسی اثر مستقیم.. 40
(3-3-4-6) تهیه نمونه های آزمایش… 41
(3-3-4-7) فیکس کردن کلونی ها 41
(3-3-4-8) رنگ آمیزی.. 41
(3-3-4-9) تابش دهی و بررسی اثر غیر مستقیم.. 41
(3-3-5) تحلیل آماری نتایج.. 41
(4-1) مقدمه. 45
(4-2) نتایج مربوط به تست های مقدماتی MTT.. 46
(4-2-1) نتایج مربوط به انتخاب تعداد مناسب سلول.. 46
(4-2-2) نتایج مربوط به تعیین مدت زمان مناسب جهت انکوباسیون سلول ها در اثر مستقیم و همسایگی پرتوی.. 48
(4-3) نتایج مربوط به تست MTT.. 48
(4-3-1) بررسی درصدبقای سلول های هدف توسط تستMTT در گروه Q-Q… 48
(4-3-2) بررسی درصد بقای سلول های همسایه توسط تست MTT.. 50
(4-4) نتایج مربوط به انتخاب تعداد مناسب سلول QU-DB برایColony assay.. 51
(4-5) نتایج مربوط به تعیین تعداد مناسب سلول با توجه به افزایش دز برای انجام تست کلونی.. 53
(4-6) نتایج مربوط به تستColony assay.. 54
(4-6-1) مرگ میتوزی سلول های هدف… 54
(4-6-2) مرگ میتوزی سلول های همسایه. 56
(4-7) نتایج مربوط به تست میکرونوکلئی.. 58
(4-7-1) نتایج مربوط به بررسی اثر غلظت در گروه Q-Q… 58
(4-7-2) بررسی اثر غلظت کامل محیط کشت تابش دیده در دزهای مختلف پرتوی درگروه Q-Q… 58
(4-7-2-1) نتایج مربوط به بررسی اثر غلظت در دز 600 سانتی گری گروه (Q-Q). 59
(4-7-2-2) نتایج مربوط به بررسی اثر غلظت در در دز 800 سانتی گری گروه (Q-Q). 62
(4-7-3) نتایج مربوط به بررسی اثر غلظت در گروه(Q-M). 64
(4-7-3-1) نتایج مربوط به بررسی اثر غلظت در در دز 400 سانتی گری گروه (Q-M). 64
(4-8) نمونه هایی از لام های مشاهده شده به وسیله میکروسکوپ… 66
(5-1) برنامه ریزی و چارچوب آزمایش… 69
(5-2) کاهشی بودن اثر در دز دزهای بالا.. 69
(5-3) مشاهده اثر تابش مستقیم پرتوی بر روی سلول های هدف(Q-Q). 70
(5-3-1) بررسی اثر تابش مستقیم پرتوی با روش MTT.. 70
(5-3-2) بررسی اثر تابش مستقیم پرتوی با روش Colony assay.. 70
(5-4) مشاهده اثر تابش غیر مستقیم پرتوی بر روی سلول های همسایه(Q-Q). 71
(5-4-1) بررسی اثر همسایگی پرتوی (Q-Q)با روش MTT.. 71
(5-4-2) بررسی اثر همسایگی پرتوی (Q-Q) با روش Colony assay.. 71
(5-5) اثر تغییر غلظت محیط کشت تابش دیده. 72
(5-5-1) بررسی اثرتغییر غلظت محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه توموری ریه در دز 600 سانتی گری(Q-Q). 72
(5-5-2) بررسی اثر تغییر غلظت محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه توموری ریه در دز 800 سانتی گری(Q-Q). 73
(5-5-3) بررسی اثر غلظت محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه طبیعی ریه در دز 400 سانتی گری.. 73
(5-6) اثر محیط کشت تابش دیده بدون سلول بر سلول های همسایه. 75
(5-7) نتیجه گیری.. 76
(5-8)پیشنهادات… 77
شکل 1‑1(اثرات بیولوژیکی مختلف پرتوی در سلول ها و بافت های تابش ندیده. 5
شکل 1‑2) نقش gap junction و ترشح هورمون ها و پروتئین ها در انتقال اثر همسایگی.. 5
شکل 1‑3) مکانیسم اثر همسایگی پرتوی ناشی از مسیر مولکولی MAPK… 9
شکل 1‑4) خلاصه ای از مسیر مولکولی یون کلسیم در ایجاد اثر همسایگی.. 10
شکل 1‑5) تعداد تغییر بیان ژن ها در حضور جاروب گر NO در محیط کشت… 12
شکل 1‑6) تعداد تغییربیان ژن ها در حضور و عدم حضور جاروب گر ROS در محیط کشت… 13
نمودار 2-1(بقای سلولی در سلول همسایه HPV-G در اثر انتقال محیط کشت سلول های مختلف هدف با غلظت های مختلف.■ مربوط به تابش دهی5 گری □ گروه کنترل مربوط به تابش دهی 5/0 گری.. 21
شکل 3‑1 (اضافه کردن محلول MTT به سلولهای تابش دیده. 37
شکل 3-2): منحنی بقا سلول در دزهای مختلف پرتوی.. 39
شکل3-3): اصول کلی تست کلونی.. 40
نمودار 4‑1) تعیین تعداد مناسب سلول QU-DB برای انجام تست MTT.. 47
نمودار 4‑2 (تعیین تعداد مناسب سلول QU-DB با توجه به شیب منحنی.. 47
شکل 4‑1) تصویری از روش کار بررسی اثر مستقیم پرتوی توسط تست MTT.. 48
نمودار 4‑3 (درصد بقای به دست آمده در تمام زیر گروه های Q-Q، Error bar معرف ± انحراف معیار می باشد. 49
در گروه Q-Qشکل 4-2 تصویری از خلاصه روش کار بررسی اثر غیر مستقیم پرتوی در گروه Q-Q توسط تست MTT می باشد. 50
شکل 4‑2) تصویری از روش کار بررسی اثر غیر مستقیم پرتوی توسط تست MTT.. 50
نمودار 4‑4(درصد بقای به دست آمده در تمامی زیر گروه های Q-Q، Error bar معرف ± انحراف معیار می باشد.(مقایسه دو اثر مستقیم وغیر مستقیم پرتوی). 51
نمودار 4‑5 (میانگین تعداد کلونی به دست آمده در غلظت های متفاوت سلولی، Error bar معرف ± انحراف معیار می باشد. 52
نمودار 4‑6 (درصد بازده کشت به دست آمده در غلظت های متفاوت سلولی، Error bar معرف ± انحراف معیار می باشد. 53
شکل 4‑3 (تصویرکلونی های سلول QU-DB توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 10 برابر. 53
شکل 4-4 تصویری خلاصه از روش کار بررسی اثر مستقیم پرتوی توسط تست Colony assay را نشان می دهد. 54
شکل 4‑4 (تصویر روش کار بررسی اثر مستقیم پرتوی توسط تست Colony assay.. 54
نمودار 4‑7 (درصد بقا و بازده کشت به دست آمده در تمام زیر گروه های Q-Q، Error bar معرف ± انحراف معیارمی باشد. 55
شکل 4‑5 (تصویر بررسی مرگ میتوزی سلول های همسایه با روش Colony assay.. 56
نمودار 4‑8 (درصد بقا و درصد بازده کشت به دست آمده در تمامی زیر گروه های Q-Q،Error bar معرف ± انحراف معیارمی باشد. 57
شکل 4‑6 (تصویر روش کار بررسی اثر غلظت های مختلف محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه. 58
نمودار 4‑9 (میانگین MN شمارش شده در زیر گروه های تابش Q-Q، Error bar معرف ± انحراف معیار می باشد. 59
نمودار 4‑10 (بررسی اثر غظت محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه ((QU-DBدردز 600 سانتی گری.. 61
نمودار 4‑11 (بررسی اثر غلظت محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه دردز800 سانتی گری.. 63
نمودار 4‑12 (بررسی اثر غلظت های متفاوت محیط کشت تابش دیده بر سلول های همسایه MRC5 دردز 400 سانتی گری.. 65
شکل4-7) نمونه ای از MNسلول های MRC5با بزرگنمایی 40.. 66
شکل4-8) نمونه ای از سلول های QU-DB با بزرگنمایی 40.. 66
جدول 1‑1) موارد اثرگذار در انتقال سیگنال اثر همسایگی پرتوی.. 6
جدول 1‑2 (سیگنال های اثرگذار داخل سلولی.. 8
جدول 4‑1) معرفی تست ها، گروه ها و توضیحات آنها 46
جدول 4‑2 (درصد بقای سلول های هدف Q-Q پس از تابش با دز های متفاوت توسط تست MTT.. 48
جدول 4‑3 (مقایسه p-value حاصل از آزمون آماری بقای زیرگروه های تابش… 49
جدول 4‑4 (درصد بقای سلول های همسایه(Q-Q) پس از تابش با دزهای متفاوت توسط تست MTT.. 50
جدول 4‑5 (مقایسه p-valueحاصل از آزمون آماری بقای زیرگروه های تابش… 51
جدول 4‑6 (چگونگی تعیین تعداد مناسب سلولQU-DB بر اساس تست پایلوت برای Colony assay.. 52
جدول 4‑7 (انتخاب تعداد مناسب سلول برای انجام تست کلونی در دزهای مختلف… 53
جدول 4‑8 (بررسی میزان مرگ میتوزی سلول های هدف QU-DBپس از تابش با دزهای متفاوت به روش Colony assay.. 54
جدول 4‑9 (مقایسه p-value حاصل از میزان مرگ میتوزی سلول های هدف پس از تابش پرتوی یونیزان با روش Colony assay.. 55
جدول 4‑10 (بررسی میزان درصد بقا سلول های همسایه پس از تابش دزهای متفاوت با روش Colony assay.. 56
جدول 4‑11 (مقایسه p-value ناشی از میزان مرگ میتوزی سلول های همسایه پس از تابش با روش Colony assay.. 57
جدول 4‑12 (تعداد MN شمارش شده در زیر گروه های تابش Q-Q… 58
جدول 4‑13 (مقایسه p-value حاصل از آزمون آماری مقایسه زیرگروه های تابش گروه Q-Q… 59
جدول 4‑14(بررسی اثر غلظت محیط کشت تابش دیده در دز 600 سانتی گری بر سلول های همسایه گروه Q-Q… 60
جدول 4‑15 (مقایسه p-value حاصل از آزمون آماری مقایسه غلظت های مختلف محیط کشت تابش دیده در دز 600 سانتی گری.. 60
جدول 4‑16 (بررسی اثر غلظت محیط کشت تابش دیده دردز 800 سانتی گری بر سلول های QU-DB… 62
جدول 4‑17 (مقایسه p-value حاصل از آزمون آماری غلظت های مختلف محیط کشت تابش دیده در دز 800 سانتی گری.. 63
جدول 4‑18 (بررسی اثر غلظت های متفاوت محیط کشت تابش دیده دردز 400 سانتی گری بر سلول های همسایه MRC5.. 64
جدول 4‑19 (مقایسه p-value حاصل از آزمون آماری غلظت های مختلف محیط کشت تابش دیده در دز 400 سانتی گری.. 65